摘要:在生物化学的科学研究和生产过程中,存在着大量的蛋白质、核酸和多肽等生物大分子的分析、分离和纯化工作,迫切需要高效快速的分析、分离和制备技术。层析技术是目前生化分析中功能最为强大的分离纯化工具之一,广泛应用于多种行业,尤其在生物实验和生物制药领域。它既可以用于少量物质的分析鉴定,又可用于物质的大量分离纯化和制备。传统层析系统只能用单一波长(280nm或260nm等)对已知组分进行检测分离,所得到的图谱结果单一且不能给出样品组分纯度等更多信息。本文研究的层析分离系统主要由层析柱分离系统和新型检测器系统组成,实现双波长(如280nm和260nm)同步检测和相应的计算机数据采集分析软件,构成一套新型双波长核酸蛋白层析分离系统。
关键词:生物分离双波长同步检测系统集成
一、引言
在生物化学的科学研究和生产过程中,存在着大量的蛋白质、核酸和多肽等生物大分子的分析、分离和纯化工作,迫切需要高效快速的分析、分离和制备技术。层析分离技术以其独特的优势始终是生物大分子纯化技术中最为常用的方法,始终占据着生物大分子分离纯化技术的主导地位,使用率占70%左右。层析系统主要由层析柱系统和检测器系统两部分组成。层析柱系统根据研究对象进行设计,包括柱体尺寸、固定相、流动相(洗脱剂)、流速等,这是一个专门的技术领域。检测器系统位于层析柱之后,是层析系统的“眼睛”,用来检测分析、分离和纯化的生物物质,是另一个技术领域。检测器主要有紫外(UV)吸收、示差折光、介电常数、电导等类型。紫外吸收检测器是柱层析系统应用最广的检测器。它具有①灵敏度高,最低检测浓度可达10-10g/mL②受操作条件和外界环境影响小,适于梯度洗脱③对无紫外吸收的物质组分无响应④为非破坏性检测,可与其他检测器串联使用等特点及优点。[1]
我国从70年代后期开始研制生产生物大分子层析装置至今,生产的层析分离系统只用单一波长(280nm或260nm等)进行检测分离,只能定性检测,难以快速识别未知组分。本研究实现了双波长(如280nm和260nm等)同步检测和数据采集分析集成,构成一套完整的双波长核酸蛋白层析分离检测系统。它的独特的优点在于能快速给出被分离样品的组分和纯度,已在实验室试用,效果良好。
二、检测原理
紫外检测器是通过测定样品组分在检测池中吸收紫外光大小来确定组分含量的。工作原理是基于光的吸收定律---朗伯-比耳定律。该定律指出,当一束单色光辐射通过稀浓度物质溶液时,如果溶剂不吸收光,则液体的吸光度与吸光物质的浓度和光经过溶液的距离成正比。其关系式为:
A=abc,I= IO*exp(-abc)
T= I/IO, LgT=(LgIO+(-abc))- LgIO=-abc =-A
所以有:A=-LgT=Lg1/T=2-LgT%
式中A为吸光度,I为透过光强度,IO为入射光强度,T为透过率,c为吸光物质的浓度,b为光在溶液中经过的距离(一般为样品厚度),a为吸光系数。若溶液的浓度单位采用 mol/L 表示,b的单位为 cm,则相应的吸光系数为摩尔吸光系数,单位为L/(mol.cm),用符号ε表示,则
A=εbc
由上式可见,吸光度与吸光系数、溶液浓度和光程成线性关系,即对于给定检测池(b为定值),在固定波长下(ε为定值),经光电转换后,紫外检测器输出一个与样品中吸收物质浓度(c)成正比的光吸收信号----吸光度(A)。实际上,光电器件输出的信号是与透过率(T)成正比,必须经过对数放大器,将透过率转换成吸光度,才能使紫外检测器输出信号与样品浓度成正比。
因此,在层析过程中,利用单一波长(如280nm)进行实时检测,以时间t(或流出液体的体积)为横轴,以吸光度A为纵轴,将连续检测的吸光度进行绘制,就得到检测物质在此波长下的层析谱(单波长层析谱)。
由朗伯--比尔定律又可知,物质在不同波长下的吸收,只与该物质的摩尔吸光系数有关,即有:
A(λ1)= ε(λ1)bc
A(λ2)= ε(λ2)bc
K(A)=A(λ1)/ A(λ2)= ε(λ1)/ ε(λ2)
△(A)=A(λ1)- A(λ2)= ε(λ1)- ε(λ2)
此比值为一常数。如果用两种(如280nm、260nm等)波长对检测池液体的吸光度进行实时同步检测,就得到一幅信息更加丰富的双波长层析谱。
为确定蛋白或核酸纯度,选用不同波长(如280nm、260nm)进行同步实时检测,在双波长图谱中进行比值运算(用280nm吸光度除以260nm吸光度),可得到比值(纯度)图谱。比值大于1.7部分为纯蛋白,比值小于0.5部分为核酸。这是鉴定蛋白和核酸纯度最为常用的方法。用单波长检测时,通常只能利用保留时间来判定组分,定性的准确度为75%左右。而利用双波长层析比例谱,定性的准确度可提高到95%。[3][2]
三、问题分析
传统层析分离装置由核酸蛋白检测仪、层析柱、恒流泵、部分收集器和记录仪等部件构成。它们仅在单一波长(如280nm或260nm)下对已知物质(蛋白或核酸)进行检测。故只能利用物质特征波长分离已知组分(蛋白或核酸),但不能进一步分析蛋白或核酸的如纯度等参数。此外,在零点调整、灵敏度选择、读数换算、使用记录仪描谱等环节的操作需要改进。
1.首先,传统层析系统的检测器虽然可能配有280nm、260nm等波长的选择,但使用时必须选定单一波长进行检测,不能同时进行双波长检测。因此,传统层析分离装置只能利用物质特征波长分离已知组分。科学研究和产品开发中需对未知混合组分进行分离或分析蛋白或核酸的纯度,传统的检测分离装置无能为力。
2.误差。由朗伯-比耳定律可知,检测仪得到的第一信号为光透过率,并非吸光度,必须要将透过率转换成吸光度。由于传统检测仪的对数转换装置误差没能得到很好的校正补偿,实际两者转换结果存在较大的误差。虽然要求使用者在检测前一定要先调整透过率为100%,然后再调整吸光度为0,使该点透过率和吸光度在此点(T=100%,A=0)符合了朗伯--比尔定律(A=lg(1/T))。但是,无法保证在测量范围内(一般取0—2A)都符合朗伯--比尔定律。事实上检测仪在不同点两者存在的误差,有的超过50%。因此,检测仪的科学性得不到保证。
2.读数。传统检测仪为保证测量时读数在仪器有效测量范围内,在仪器面板上都设有灵敏度选择装置(2.0A、1.0A、0.5A、0.2A、0.1A、0.05A等),由此会带来:①当对未知样品浓度不甚了解,不知如何选择灵敏度,需要反复摸索;②仪器显示值不是样品吸光度值,真正吸光度值是仪器显示数与灵敏度的乘积;③如在测量时改变仪器的灵敏度将会带来严重后果(基线变化大)。
3.繁琐。传统检测仪在不同灵敏下的测量结果均为0-10mv直流信号,将此信号输出到记录仪上,选择适当的记录仪走纸速度,在记录纸上绘出吸光度谱。可想而知,记录纸上的吸光度也并非样品实际的吸光度,也受到仪器灵敏度的调制。要想从记录纸上得到吸收峰的面积、归一化等参数将是一件费工耗时、十分繁琐的事。再者,纸质谱图提供的信息单一且难以保存,更不能直接在文章中插入使用。
四、设计思路
以对蛋白、核酸、肽等生物大分子物质的分离纯化为目的,新型双波长核酸蛋白层析分离系统包括以下三个部分。
1.层析柱系统。包括层析柱、固定相、流动相、恒流泵等。
2.检测器系统。大分子生物物质对不同波长的光有不同的吸收,在紫外区常存在某一最大吸收波长,称为特征波长,如蛋白特征波长为280nm,核酸特征波长为260nm,肽键物质特征波长为215nm等。利用特征波长虽可初步了解混合溶液的大致情况,但单一波长难以快速确定未知样品的组分。如果混合物中有多个组分在同一波长下均有吸收(如蛋白和肽键物质在280nm下都有吸收),仅用一个波长甚至难以定性地判定其组分。用两种波长(280nm和215nm)同时检测出吸收谱,不仅可以评价样品组分、纯度、重叠峰定量以及去除干扰等。还可在双波长层析谱上得到两个波长(280nm和260nm)光吸收的比例(或比差)图谱,可确定蛋白、核酸等组分和纯度,迅速达到期望的生物大分子物质分离纯化的效果。[1][2][3]
3.软件分析系统。该系统由电脑、打印机和分析软件组成。应用分析软件具有数据采集、实时描谱、分析参数、图谱保存、图谱打印、图谱编辑等功能。可以分析峰高、峰宽、峰面积、归一化、保留时间、半峰宽、折点峰宽、面积含量、纯度、层析柱分辩率等。[4]
五、解决方案
为彻底解决传统层析分离装置存在的误差大、读数不直观、用记录仪描谱、只能单波长检测等问题。本系统的设计以朗伯-比尔定律为依据,在光源设计、光路设计、模拟放大、对数放大、A/D转换、数字控制、嵌入式技术以及电脑工作站等方面使用了全新的设计理念。实现光源在200nm—400nm波长内的能量基本均衡,将分光滤光后的两束单色光射入样品池,经光电转换后得到两路电信号。通过较长时间的研究、试验和用户使用,完成了“双波长核酸蛋白层析分离系统”的设计和研制。该集成系统实现了:
1.吸光度和透过率严格符合朗伯-比尔定律(A=Lg(1/T)),测量范围内任意两者(A和T)对应误差小于1%。
2.系统智能调整吸光度到0.000,透光率到100%。
3.280nm和260nm(或215nm)同步实时检测。
4.系统自带数据采集工作站和标准电脑接口(COM口和USB接口),检测、采集、软件工作站一体化系统集成。
5.层析谱分析软件具有数据采集、实时描谱、分析参数、图谱保存、图谱打印、
图谱编辑等功能。
6.分析参数有峰高、峰宽、峰面积、归一化、保留时间、半峰宽、折点峰宽、面积含量、纯度、层析柱分辩率等。据[4]
六、系统实验(实施例)
1.实验样品:HB-VB2混合液
2.实验仪器:
层析柱(长20cm,内径1.0cm)
HL-2恒流泵
ZHD-D双波长核酸蛋白检测仪
层析谱电脑采集分析软件
移液器
铁架台
3.实验装置:
4.实验方法:固定相为葡聚糖凝胶G25,加样量2mg,配0.05mol磷酸缓冲液洗脱。
5.洗脱图谱:
图1(Figure 1)
图2(Figure 2)
6.图谱说明:图1(Figure 1)为双波长洗脱图谱,图2(Figure 2)为在图1基础上得出的比例图谱。可以看到层析系统已将两种组分完全分离。又由比例图谱可以知道:HB蛋白纯度较高(比值大于1.7),VB2蛋白纯度较低。之后用9100紫外-可见光分光光度计(北京)对HB样品吸收率值进行测量,结果为:在280nm波长下吸收率值为0.414, 在260nm波长下收率值为0.201,两波长下吸收率的比值大于1.7,和双波长核酸蛋白检测分离系统得出的结论相一致。
八、结束语
本研究成果为生化分离技术提供了一种新的简便有效的手段。不仅可以用于大中专院校的生化实验中对生物样品进行分离认知实训,还可用于生物制药过程中对蛋白或核酸在上游进行分离纯化和制备,提高了科学研究和生产效率。
参考文献:
[1]、张晓彤,云自厚.液相色谱检测方法.北京:化学工业出版社,2001. 19—45
[2]、何忠效.生物化学实验技术.北京:化学工业出版社,2004. 22--70
[3]、余冰宾.生物化学实验指导.北京:清华大学出版社,2004. 45--79
[4]、熊开元.仪器分析.北京:化学工业出版社,1998. 72--78