打开文本图片集
摘 要：DNA逻辑门在分子计算机和分子水平上的计算技术中具有重要作用。我们通过设计核酸适体与凝血酶特异结合导致胶体金团聚的方法，构建了凝血酶的DNA逻辑门。凝血酶作为输入信号与其核酸适体结合，将监测探针上的胶体金结合位点释放，两个核酸功能化修饰的胶体金同时结合到监测探针上，引起胶体金团聚，实现信号输出。根据这个设计原理，成功构建了蛋白质凝血酶的YES逻辑门。关键词：DNA逻辑门；凝血酶：胶体金：核酸适体
中图分类号：Q955 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）03-0210-03
以核酸为基础的分子计算机或者分子水平上的信息处理有望代替传统的以硅作为原件的计算机技术，在生物医学领域具有重要意义[1-6]。这是因为核酸与以硅为基础的生物运算相比具有结构简单、能和其互补链杂交，以及能与目标分子f金属离子、小分子、蛋白质）相互作用的特点，在构建DNA计算机方面有巨大优势。设计并构建DNA逻辑门引起了国内外广大研究者的兴趣[7～13]。如：汪尔康院士利用核酸置换技术和G四聚体组装技术构建逻辑门，在体外模拟控制光敏剂PPIX的释放[8]；Song等采用两个DNA origami纳米结构构建用于microRNA检测的逻辑门[9]；Xu等利用连接酶形成环形DNA分子构建逻辑门[10]；Winner等构建了一个基于离子的DNAzyme逻辑门实现U022+的灵敏检测等等[11]。
在本文中，我们利用核酸适体和胶体金技术构建了一种新型的DNA逻辑门，用于蛋白质凝血酶分析。核酸适体是经体外筛选技术SELEX（指数富集配体系统进化）筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适体在生物传感器、新药开发以及纳米技术等方面有着厂一泛的用途[14]。本文选用凝血酶蛋白质作为逻辑门的输入，利用凝血酶与其核酸适体特异结合，释放出监测探针上的胶体金结合位点，引起胶体金团聚，实现逻辑门信号输出，实现凝血酶分析。
1试验方法
1.1试剂与仪器
试剂：本文中所用寡核苷酸由大连宝生物公司合成。Nl：CTT CTT GGC AGT CCG TGG TAGGGC AGG TGG GGG TGA CT； N2：GCC AAG AAGGGG GAC TGC CAA GAA G：N3： SH - TTTT CT-TCTTGGC。Nl是凝血酶核酸适体序列；N2是监测探针序列；N3序列在5 7端修饰有巯基。HAu-Cl4、BSA、HSA、IgG，柠檬酸三钠购自上海生工生物有限公司，凝血酶购自北京鼎国生物有限公司，所用其他化学试剂均为分析纯。仪器：紫外可见分光光度计（UV 1750日本岛津）。
1.2 实验方法
1 .2.1 胶体金的制备
该方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。首先将100 ml_， O.O1%的HALiCl4溶液在加热搅拌器上搅拌加热至沸腾，迅速加入4.5 mL l%的柠檬酸三钠水溶液并继续搅拌加热。煮沸7～10min，最后定格为透明酒红色。室温冷却，封存于4 °C的冰箱中。
1.2.2胶体金的核酸功能化修饰
首先将制得的金溶胶浓缩1倍，于1mL浓缩的纳米金中缓慢加入N3溶液，室温放置16 h后逐滴加入100 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.4），随后加入2 mol/L NaCl进行老化。离心分离，最后将沉积物分散于10 mmol/L PBS中，4 °C保存备用。
1.2.3 紫外吸收光谱的测定
配制底液：20 mmol/L Tris-HCl （pH=7.4），2 mmol/L MgCl2。在底液中加入10 nmol/L凝血酶和100 nmol/L Nl，孵育30 min，再加入100 nmol/LN2和N3，孵育5 min后在紫外可见分光光度计上进行测定。特异性实验过程和凝血酶实验过程一样，只是用其他蛋白（BSA、HSA、IgG）代替凝血酶。以上反应温度为室温。
2 结果与分析
通过二进制“1-0”概念设计的可进行特殊运算的逻辑门，有一个输入便有一个输出结果。“YES”门是当输人为1时输出也为1。我们把蛋白质凝血酶作为输入信号，胶体金团聚信息作为输出信号，利用凝血酶与其核酸适体特异相互作用导致胶体金团聚的原理，构建了YES逻辑门。示意图见图1。逻辑门由链Nl、N2和N3组成。Nl是核酸适体序列，由两部分组成，一部分是凝血酶的核酸适体序列，另一部分能与N2互补，封闭胶体金结合位点；N3是核酸功能化修饰的胶体金（Au-DNA）；N2是监测探针序列，有两个相同的Au-DNA结合位点。当N2监测探针上的两个Au-DNA结合位点同时与Au-DNA结合时，胶体金团聚，引起胶体金吸收峰值下降，甚至吸收峰红移；但是当没有凝血酶输入时，核酸适体与监测探针结合，封闭胶体金结合位点，则不能引起胶体金团聚，没有吸收峰值下降或吸收峰红移现象，从而没有信号输出。
从图1可以看出，作为逻辑门信号输出方式的功能化胶体金对逻辑门构建具有重要意义。我们首先检测了核酸功能化修饰的胶体金（图2）。我们发现新制备的胶体金在522 nm有一个明显的吸收峰，但是加入钠离子后，吸收峰发生明显的红移，且522 nm处吸收明显下降（图2A）；但是当胶体金用核酸进行功能化修饰后，加入钠离子，我们发现吸收峰没有明显的偏移，同时522 nm处的吸收值没有显著变化。这些结果说明胶体金进行了很好的核酸功能化，即使加入较高浓度的盐条件下仍然能保持良好的分散性能，能够很好地用于逻辑门构建。
YES门是逻辑门中最简单的门之一。当有输入信号时，就有输出信号产生。在图3中，发现输入凝血酶，在522 nm的吸收值发生明显下降，吸收峰明显红移；而没有凝血酶时，在522 nm有一个明显的吸收峰。这是因为凝血酶与核酸适体结合，将探针上胶体金结合位点释放，加入核酸功能化修饰的胶体金，两个胶体金同时结合到探针上，导致胶体金团聚，输出信号；当没有凝血酶输入时，不能有效释放胶体金结合位点，功能化胶体金不能同时结合到探针上，则不能输出信号。上述结果证明我们有效地构建了以凝血酶为输入信号，以胶体金团聚为输出信号的YES逻辑门。
最后我们探索了新研制的DNA逻辑门的特异性。这是因为作为分子计算机基础的DNA逻辑门为实现疾病的诊治及预后，必须具有好的特异性[3-5]。我们用非凝血酶蛋白质（BSA、HSA、IgG）对逻辑门的特异性进行了研究。结果显示在图4中。我们发现当输入BSA、HSA、IgG等蛋白质时，吸收峰及吸收值都没有明显变化，但是当输入凝血酶蛋白质时，522 nm吸收峰明显降低，峰出现明显红移。这些实验说明逻辑门具有好的特异性。
3讨论
我们根据核酸适体和蛋白质特异性结合，引起功能化胶体金团聚的特性，构建了凝血酶输入信号的YES逻辑门，快速监测凝血酶在样品中的存在。当我们将凝血酶的核酸适体设计为其他蛋白质或小分子的核酸适体时，依据该逻辑门构建方法，我们可以构建其他蛋白质或小分子的逻辑门，从而实现更多蛋白质等物质的监测，在临床上为疾病的防治将有重要的作用。