摘要 猪呼吸道病综合征是一种多因子性疾病。通过设计1对针对16s rDNA的引物，建立了该病原的PCR检测方法，该方法能从标准株和分离株中获得阳性扩增，但不会与其他种类支原体或者是猪呼吸道中的常见微生物发生交叉反应。为证实扩增产物的特异性，对2个PCR产物进行纯化、测序和序列分析，证实为肺炎支原体。
关键词 猪肺炎支原体；PCR；检测方法；建立
中图分类号 S858.28；S852.62；Q78 文献标识码 A 文章编号1007-5739（2012）03-0319-03
猪支原体肺炎即猪地方流行性肺炎（swine enzootic pne-umonia），俗称猪喘气病。因其病原为霉形体，又称猪霉形体肺炎（mycoplasma hyopneumoniae M. suipneumoniae）[1]。猪支原体肺炎是一种慢性呼吸道传染病，除了能引起猪地方流行性肺炎外，也是猪呼吸道疾病综合征的一种原发性病原[2]。该病自然感染仅见于猪，引起猪地方流行性肺炎。病猪生长发育迟缓，饲料转化率低，抵抗力下降；另外，支原体肺炎可继发多种疫病，如PRRS、圆环等，这些疫病的病原体均可损伤、破坏肺泡的巨噬细胞和淋巴细胞，造成免疫抑制，从而导致多种疫苗接种失败[3-5]。此外，猪喘气病还易与其他疫病如猪肺疫、传染性胸膜肺炎等并发，造成更大的危害。猪肺炎支原体病能对养猪业造成重大经济损失，是最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一。
鉴于该病对规模化养殖场危害较大，而常规的病原分离检测方法耗时长，对控制疫病的流行以及把握最佳治疗时间不利，且猪肺炎支原体的抗原与猪体内的其他支原体如猪絮状支原体、猪鼻支原体、滑液支原体存在交叉反应，利用传统的病原分离和ELISA很难加以区分。因此，建立一种快速、准确、简便、灵敏度高、特异性强的方法就显得尤为重要。本试验根据GenBank中的Mhp 16s rRNA基因设计引物，扩增出1个大小为649 bp的特异性片段。经克隆并测序表明，与GenBank中Mhp序列的同源性为100%。而对于常见的猪呼吸道疾病有关的病原猪鼻支原体、支气管败血波氏杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌以及鸡毒支原体则不能扩增出特异性片段，表明该引物具有高度的特异性，从而可以为猪肺炎支原体病的快速诊断提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株来源。猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）、鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticam，Mg）、猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis，Mh）由云南农业大学动物医学教学实验中心分离鉴定保存；葡萄球菌（Staphylococcus）、支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）、副猪嗜血杆菌（Haemophilrs parasuis）均由云南农业大学动物医学实验教学中心分离，并经生化鉴定。
1.1.2 病料来源。分别采自云南省各地疑似猪肺炎支原体病变肺脏，共16份，保存于-20 ℃冰箱中。
1.1.3 猪肺炎支原体分离培养基。按“中华人民共和国农业行业标准”制备[6-7]（略有改动）。
1.1.4 生物试剂及工具酶。10×EX Buffer、dNTP、EX Taq聚合酶、rTaq聚合酶、PMD18-T Vector、SolutionⅠ、EcoRⅠ均购自大连宝生物工程有限公司，感受态细胞E.Coli购自北京博迈德科技发展有限公司，DNA凝胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，细菌DNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，组织DNA抽提试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。
1.1.5 常规试剂。无支原体新生犊牛血清、猪胃消化液、牛心浸液、胰蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉、纯化琼脂、氯仿、异丙醇、异戊醇、乙醇（无水乙醇95%乙醇）、Tris-碱、Tris-酚、SDS、氯化钠等试剂均由云南农业大学动物医学实验教学中心提供。
1.2 试验方法
1.2.1 病料处理。将所采集到的16份疑似猪肺炎支原体病变肺脏解冻，在无菌平皿中剪成大小为2 mm3小块，接种于支原体液体分离培养基中分离培养。根据培养基的颜色变化以及培养时间来确定有没有分离到肺炎支原体，颜色变黄者再进一步传代，并转移到固体培养基中培养，进行狄氏染色和生化试验确定。
1.2.2 支原體DNA的提取。取支原体培养物1.5 mL，于12 000 r/min离心1 min，弃上清，以下操作步骤按照上海生工生物技术服务有限公司细菌总DNA抽提试剂盒中的操作说明进行DNA提取，用1.5%琼脂糖凝胶电泳确定抽提效果，-20 ℃冷冻保存。
1.2.3 病料DNA的提取。取肺脏约0.5 g，用眼科剪将其剪成肉末，放入经高压灭菌的EP管中，以下操作步骤按照北京百泰克组织总DNA抽提试剂盒中操作说明提取病料DNA。1.5%琼脂糖凝胶电泳查看抽提效果，并于-20 ℃冷冻保存。
1.2.4 引物的设计。根据GenBank中MHP 16s rDNA中基因系列设计1对特异性引物，MHP-F 5′-GAG CCT TCA AGC TTC ACC AAG A-3′，MHP-R 5′-TAT GTT AGT GAC TTT TGC CAC C-3′，并提交上海生工生物技术服务有限公司进行合成。
1.2.5 PCR反应。按常规方法进行，反应体系为10×Ex Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmoL）1.5 μL，Ex Taq 0.5 μL，上下游引物（10 pmoL/μL）各1 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O至25 μL。按下列反应参数进行PCR反应：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，34个循环后，72 ℃终延伸5 min。扩增结束后取上述扩增产物5 μL，加6×Loading Buffer 1 μL在含有溴化乙锭（EB）1.5%的琼脂糖凝胶于120 V电压下电泳观察结果。
1.2.6 扩增产物的纯化回收、转化、克隆及酶切鉴定。扩增产物的纯化回收按照北京百泰克生物技术有限公司胶回收试剂盒中操作说明进行，取纯化后的16s rDNA的PCR产物0.5 μL与PMD18-T 0.5 μL、Solution Ⅰ5 μL，16 ℃下连接30 min，将连接产物加入感觉态细胞E.Coli 50 μL中，在冰水中放置30 min，转入42 ℃水浴45 s，再转入冰水中放置1 min后，加890 μL LB培养基37 ℃振荡培养1 h，取培养物接种于含氨苄（80 μg/mL）LB固体培养基上培养12 h，再挑取平板上的白色菌落接种于含氨苄（80 μg/mL）LB液体培养基上振荡培养过夜。取过夜培养菌液1 mL离心提取质粒，其操作步骤按照分子克隆实验指南中质粒的小量制备操作方法进行。酶切的反应体系为质粒3 μL、EcoR Ⅰ0.5 μL、EcoR ⅠBuffer 2 μL、ddH2O 14.5 μL，37 ℃反应2 h后，取10 μL酶切产物在2%琼脂糖凝胶电泳上观察酶切结果。
1.2.7 序列分析。将已酶切鉴定含目的基因的原核细胞送往上海生工生物技术服务有限公司进行测序，与GenBank中的Mhp序列相比较。
1.2.8 PCR特异性测定。用Mhp-F和Mhp-R上下游引物分别与猪鼻支原体、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、鸡毒支原体、葡萄球菌病原的DNA作为模板，反应条件按1.2.5进行PCR扩增，电泳观察结果。
2 结果与分析
2.1 常规病原分离结果
所采集的16份病料，经常规分离培养后未见培养基颜色发生改变，镜检未见可疑菌体。
2.2 分子生物学结果
2.2.1 PCR反应。所提取的病料模板用Mhp-F和Mhp-R引物经PCR扩增后，其中有1份病料扩增出特异性条带，其余病料DNA并未扩增出特异性条带，具体的PCR扩增结果见图1。
2.2.2 酶切鉴定。从转化、克隆后的原核生物中提取的质粒，经EcoRⅠ酶切，酶切产物电泳，结果可见2 818 bp和499 bp大小的2条明亮特异带，具体见图2。
2.2.3 序列测定结果。经测序的核苷酸序列与GenBank中的Mhp进行同源性比较，结果为100%。
2.2.4 PCR特异性测定。用Mhp-F和Mhp-R引物与呼吸道有关的病原猪鼻支原体、鸡毒支原体、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌、葡萄球菌的DNA为模板进行PCR扩增，结果显示Mhp-F和Mhp-R引物只能对Mhp扩增出649 bp的特异性条带，其余并未扩增出特异性条带（图3）。表明所设计的引物具有高度的特异性。
3 结论与讨论
传统的病原鉴定一直以分离培养为前提，然后再依据形态、生理生化反应特征以及免疫学特征加以鉴定，20世纪60年代末Woese CR开始采用寡合苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞核糖体RNA特征系列认为16s rRNA及其类似的RNA基因系列作为生物系统发育指标最为合适，其主要依据是：它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，客观存在的序列变化与进化距离相适应[8]。在细菌鉴定中，16s rRNA基因序列分析技术能够精确到种的水平，可以用来鉴定用其他方法难于区别的细菌[9]。因此，可通过16s rDNA基因系列设计相应引物来扩增特异性片段，而且PCR敏感性高、特异性强，对于一些难分离、难培养、人畜共患的病原有较好的适用价值。
猪肺炎支原体在作常规的病原分离过程中需要10～25 d培养基的颜色才能发生变化，再加上生理生化形态学的鉴定至少需要30 d以上的时间才能确诊，这样与疾病的快速诊断、治疗相违背，不利于临床实践中对此疾病的确诊，而且猪感染猪肺炎支原体时，常伴有猪鼻支原体和絮状支原体的感染，由于猪肺炎支原体较猪鼻支原体和絮状支原体培养条件苛刻、生长缓慢，因此在分离培养猪肺炎支原体时常被另外的2种支原体所掩盖，且三者在血清学反应上具有一定的交叉性，采用血清学方法检测此病可能出现假阳性反应。本实验通过Mhp 16s rDNA基因系列设计出特异性引物，扩增出649 bp的特异片段，而对于常见的与呼吸道疾病有关的猪鼻支原体、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、鸡毒支原体、葡萄球菌不能扩增出649 bp的特异片段，说明了该方法具有很高的特异性。在所采集的病料中，采用常规病原分离培养法并没有分离出支原体阳性菌株，而采用所建PCR方法检测出1份阳性病料，并经克隆、测序后经BLSAT比较，结果同源性为100%。表明所建立的PCR方法具有快速、灵敏、特异性强的优点。
在PCR反应条件优化过程中，不同的退火温度和模板量的大小对PCR反应条件尤为重要。本实验通过52～57 ℃的退火温度和0.5～2.0 μL的不同模板量大小进行了PCR反应条件优化。结果表明，退火温度较低和模板量的使用量较大，虽能扩增出明亮特异性条带，但是出现了非特异性条带，不利于下一步的分子克隆和容易产生错误判断。退火温度达到57 ℃、模板量在2 μL时，虽无非特异性条带，但是特异性条带不够明亮，在对病料DNA扩增时易出现假阴性现象，不利于临床实践中对猪肺炎支原体的检测诊断。退火温度在54 ℃、模板量在0.5 μL时能得出无非特异性条带的核苷酸片段，但是特异性条带又不够明亮。最后经大量重复对比实验得出在退火温度为54 ℃、模板量在1 μL时能获得较为理想的实验效果[10]。
4 参考文献
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