摘要
近年來，小新壳梭孢Neofusicoccum parvum导致的核桃枝枯病屡有报道，该病防治困难，发病率高，是核桃的一种灾难性病害。为建立N.parvum的快速、灵敏的分子检测体系，根据N.parvum的几丁质合酶1基因（CHS1）及其前后100 bp序列，分别设计了两对特异性引物CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA，建立了N.parvum的巢式PCR检测方法。结果表明，建立的体系可以从不同来源的5个N.parvum菌株中特异性地扩增出97 bp的目的条带，灵敏度达30 fg/μL，是常规PCR的10倍，而从其近缘种葡萄座腔菌属Botryosphaeria sp.的病原菌及其他供试菌株均未扩增出任何条带。以感染N.parvum的核桃组织总DNA为模板进行检测，可以在发病早期检测出N.parvum的存在。本研究建立的巢式PCR体系可以为核桃枝枯病的田间检测提供思路。
关键词
核桃枝枯病； 小新壳梭孢菌； 分子检测； 巢式PCR
中图分类号：
S 763.13
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017262
Establishment of nested PCR method for detecting the branch dieback of
walnut caused by Neofusicoccum parvum
CHEN Jie， ZHU Tianhui
（College of Forestry， Sichuan Agricultural University， Wenjiang 611130， China）
Abstract
The branch dieback of walnut caused by Neofusicoccum parvum has repeatedly been reported in recent years. The disease is a catastrophic disease of walnut with high incidence and is difficult to control. In order to establish a rapid and sensitive molecular detection system for N.parvum， two pairs of specific primers， CTWK3S / CTWK3A and CTNS / CTNA， were designed according to the sequence of chitin synthase 1 （CHS1） of N.parvum and 100 bp flanking sequences， and a nested PCR detection assay was established for N.parvum. The results showed that the established assay was specific to five strains of N.parvum from different sources and could amplify a 97 bp target with a sensitivity of 30 fg/μL， which was 10 times more sensitive than conventional PCR. No products were amplified in the related pathogenic species， Botryosphaeria sp.， as well as the other tested strains. Therefore， the total DNA of walnut infected by N.parvum can be used as a template to detect the presence of N.parvum early in the disease. The nested PCR system established in this study can provide ideas for field detection of walnut branch dieback.
Key words
walnut blight； Neofusicoccum parvum； molecular detection technology； nested PCR
据统计，目前我国核桃栽培面积达554.78万hm2，占全国经济林总面积的14.96%，比2002年增加464.91万hm2，有10个省（自治区）的种植面积在10万hm2以上[1]。与此同时，核桃的各类病虫害也日益频发，其中核桃枝枯病在全国各地均有发生。引起核桃枝枯病的病原菌已报道的有矩圆黑盘孢Melanconium oblongum[24]、胡桃黑盘孢M. juglandina[56]、胡桃楸拟茎点霉Phomopsis juglandina[7]、茎生拟茎点霉P.truncicola[8]和小新壳梭孢Neofusicoccum parvum[910]。目前国内外研究较多的是M.oblongum，而对其他引起核桃枝枯病的病原菌则研究较少。2013年，Cheon等首次报道了N.parvum在韩国引起核桃枝枯病[11]，而后该病原菌引起的核桃枝枯病陆续又在我国山西和四川有过报道[1213]。
小新壳梭孢Neofusicoccum parvum属子囊菌门Ascomycota，子囊菌纲Ascomycetes，假球壳目Pleosporales，葡萄座腔菌科Botryosphaericeae，新壳梭孢属Neofusicoccum，在田间主要借风、雨或昆虫传播，并可通过自然孔口或机械损伤等侵染枝条[14]。
近年來已发展了多种植物病原菌的分子检测技术，其中巢式PCR扩增技术是由内外两对引物先后对靶序列进行扩增，使其DNA拷贝数以双重指数级增加，因而灵敏度也大幅度提高。该技术已被广泛应用于多种植物病原菌的分子检测，如荔枝霜疫霉[15]、菜豆晕疫病菌[16]、甘蔗黑穗病菌[17]、琯溪蜜柚黑斑病菌[18]、向日葵白锈病菌[19]等。
目前，国内外关于核桃枝枯病分子检测技术的研究鲜有报道。本研究根据N.parvum的CHS1基因及其前后100 bp序列设计特异性内、外引物，拟建立一种快速、灵敏的巢式PCR检测体系，为我国核桃枝枯病早期防治提供技术支持。
1 材料和方法
1.1 材料
菌株：供试菌株详细信息见表1。
引物：采用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0，根据GenBank中公布的N.parvum的CHS1和基因组序列，设计两对特异性引物，即：外引物：CTWK3S（5′GTGTCTATCAGGACGGCATTG3′）/CTWK3A（5′CGAGGACGGTTCCAAAGG3′）预计扩增片段大小为271 bp和内引物CTNS（5′GGACGGCATTGCCAAGCA3′）/CTNA（5′TTAGCGTCTTTCCACGGGTCTT3′），预计扩增片段大小为97 bp。引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。
马铃薯葡萄糖培养基（PDB）：煮熟马铃薯滤液200 g/L，葡萄糖20 g/L；LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L。固体培养基为在对应液体培养基中加15～20 g/L琼脂粉。
试剂及仪器：离心柱型植物基因组提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit DP305）、DL2000 DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、2×Taq PCR Master Mix （KT201）及琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；大肠杆菌菌株Escherichia coli DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；pMD19T载体购自宝生物工程有限公司；50×TAE Buffer购自索莱宝科技有限公司；西班牙琼脂糖，BIOWEST公司生产；Gold ViewⅠ核酸染色剂购自索莱宝科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 PCR模板的制备
菌株培养：用打孔器从接菌7 d的PDA平板中取直径5 mm的菌饼接种于装有灭菌PDB的锥形瓶中，28℃恒温140 r/min振荡培养5 d。
菌丝获取：菌丝的获取参照何月秋[20]的方法，置于冰箱-20℃保存待用。
核桃发病组织获取：用针刺法在健康两年生核桃植株的枝条上接种N.parvum菌饼，用无菌水喷湿后覆盖保鲜膜置于室外通风处，随后观察发病情况。在核桃枝枯病发病时期分不同发病情况（表2）用消毒后的刀片采集接种枝条的韧皮部，对样品进行表面消毒后置于冰箱-80℃保存待用。
DNA的提取：核桃样品组织DNA提取参照天根植物基因组DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Extraction Kit）说明书；供试菌株DNA提取参照刘少华等[21]的方法。用Biomate 3S紫外可见核酸蛋白分析仪测定吸光值，估算DNA的质量和浓度后置于-20℃保存待用。
1.2.2 PCR扩增体系
常规PCR扩增体系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 mmol/L外引物（或内引物）各 2.0 μL，模板DNA 2.0 μL，用双重蒸馏水补足至50 μL。程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸20 s，33个循环；最后72℃延伸8 min。
巢式PCR扩增体系：以外引物进行第一轮PCR，扩增体系同常规PCR，扩增程序除退火温度改为53℃和延伸时间改为30 s外其他同常规PCR。取第一轮产物稀释10倍后，以内引物进行第二轮扩增，体系和程序同常规PCR。
电泳检测：4%的琼脂糖凝胶，110V电压下电泳40 min。
1.2.3 巢式PCR引物退火温度的筛选
以外引物和内引物分别扩增N.parvum基因组DNA，退火温度梯度设置为45～55℃，其他程序及体系同1.2.2常规PCR。
1.2.4 巢式PCR引物特异性验证
用引物对CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA对所有供试菌株基因组DNA进行巢式PCR扩增，体系及程序见1.2.2巢式PCR。
1.2.5 PCR产物的克隆及序列分析
用引物对CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA对N.parvum基因组DNA进行巢式PCR扩增，产物电泳后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化、克隆至pMD19T载体中，并转化至DH5α感受态细胞中，取100 μL涂平板，37℃培养过夜，随即挑取单菌落接种到LB培养基中，37℃振荡培养4 h，用菌液PCR筛选阳性克隆，随机选择3个阳性克隆送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。将得到的产物序列经NCBI在线BLAST比对验证其来源，再用DNAMAN分析其与目的片段的一致性。
1.2.6 巢式PCR灵敏度试验
用特异性引物对CTNS/CTNA和CTWK3S/CTWK3A分别对浓度为300 ng/μL、30 ng/μL、3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL的N.parvum基因组DNA进行常规PCR扩增和巢式PCR扩增，设置无菌ddH2O为阴性对照，扩增体系及程序同1.2.2。
1.2.7 发病组织检测
以1.2.1中不同发病等级的核桃组织及健康核桃组织的DNA作为模板，分别进行CTWK3S/CTWK3A常规PCR、CTNS/CTNA常规PCR和巢式PCR，扩增体系及程序同1.2.2。
2 结果与分析
2.1 巢式PCR引物退火温度优化
以外引物CTWK3S/CTWK3A进行扩增时，不同退火温度下扩增N.parvum基因组DNA的结果见图1，结果表明该对引物在退火温度45～55℃时均能很好地扩增出目的条带，且无杂带产生。为了保证扩增产物的产量和引物的特异性，最终选择55℃作为该对引物的退火温度。以内引物CTNS/CTNA进行扩增时，不同退火温度下扩增N.parvum基因组DNA的结果见图2，结果表明该对引物在退火温度45～55℃均能扩增出目的条带，但均有非目的性条带产生。为了使引物的特异性最佳，最终选择53℃作为该对引物的退火温度。
2.2 巢式PCR特异性检测
外引物对CTWK3S/CTWK3A常规PCR扩增结果见图3，5个不同来源的N.parvum均扩增出了非常明亮的271 bp的目的条带，但其他菌株也都有微弱非特异性目的条带出现。内引物对CTNS/CTNA常规PCR扩增结果见图4，5个不同来源的N.parvum均扩增出了不甚明亮的97 bp的目的条带，但葡萄座腔菌属Botryosphaeria的3个菌株（图4，泳道6～8）可见一条约500 bp的微弱非特异性目的条带，其他10个菌株均无条带出现。巢式PCR检测结果见图5，5个不同来源的N.parvum均扩增出了97 bp的特异性目的条带，而其他18个菌株均无条带出现。
2.3 巢式PCR灵敏度检测
用内侧特异性引物对CTNS/CTNA进行常规PCR，能检测到300 fg/μL的N.parvum总DNA（图6），而用外侧引物对CTWK3S/CTWK3A的PCR产物稀释10倍作为模板，再用内引物对CTNS/CTNA进行巢式PCR能检测到30 fg/μL的N.parvum总DNA（图7）。表明巢式PCR靈敏度是常规PCR的10倍。
2.4 测序结果
阳性产物克隆测序后在NCBI数据库进行在线BLAST对比分析，结果表明，本试验选取的3个阳性克隆的序列与N.parvum CMW9071菌株（GenBank登录号为EU339498.1）、MUCC211菌株（GenBank登录号为EU339500.1）和CMW7772菌株（GenBank登录号为EU339495.1）的序列一致性达100%，100%和99%，用DNAMAN软件包分析比对表明，序列与巢式PCR预测产物一致。
2.5 核桃发病组织检测
不同发病情况的组织及健康组织DNA分别以CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA进行常规PCR检测和巢式PCR检测，结果见图8。两对引物的常规PCR均只能检测出3级、2级和1级发病组织内病原菌，其中CTWK3S/CTWK3A还扩增出了约850 bp的明显杂带，而巢式PCR可以检测出4级、3级、2级、1级和0级发病组织，且呈单一条带，表明其灵敏度和特异性都明显高于常规PCR。
3 讨论
一种高特异性、高灵敏度的分子检测方法能否成功建立，关键在于靶序列的选择。目前，已报道的分子检测技术常用靶序列主要有核糖体RNA基因的内转录间隔区（ITS）[22]、细胞骨架蛋白（betatubulin）基因[23]、肌动蛋白（actin）[24]基因、水稻抗稻瘟病基因（Pi）[25]、转录延伸因子（factor 1alpha）[26]、热激蛋白（heat shock protein）基因[27]、线粒体NADH脱氢酶基因（NADH 1）[28]、RNA聚合酶Ⅱ第2大亚基基因（RPB2）[29]等。众所周知，不同物种的基因保守序列不同，同一物种的同一基因变异程度也不同，而植物病原菌作为典型的R策略者，其种群增长率大，种内遗传多样性丰富，所以寻找一个合适的分子检测靶基因并不是一件轻而易举的事。
几丁质合酶是促成几丁质分子延长的酶，而CHS1的主要作用则是在细胞分裂中合成几丁质。该基因在植物病原检测中还未见报道，但曾在动物皮肤病病原分子检测中有作为靶基因的报道，如李晓红等[30]基于申克孢子丝菌的CHS1基因建立了孢子丝菌病PCR分子检测方法。
N.parvum导致的核桃枝枯病在韩国以及我国山西和四川有发生[1113]。本试验虽选择了5个不同来源的N.parvum菌株进行了巢式PCR分子检测技术的研究，但由于病原菌种群内遗传多样性较丰富，所以该技术是否能够成功检测其他更多来源的病原菌还有待下一步验证。
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