摘要：研究根据GenBank发表的犬瘟热病毒（CDV）F基因保守区设计合成一对特异性引物，建立检测CDV RT-PCR方法。结果表明，该方法扩增的产物与预期大小相符，对犬腺病毒、犬细小病毒和狂犬病病毒的扩增结果均为阴性；对倍比稀释的CDV cDNA进行检测，其敏感度可达100 TCID50；对30份CDV疑似病例检出的阳性率为100%，而犬瘟热抗原检测卡检出CDV的阳性率为90%。证明建立的RT-PCR方法特异性强、敏感性高，可用于CDV的检测及分子流行病学调查。
关键词：犬瘟热病毒；RT-PCR；F基因；检测
中图分类号：S85文献标识码：A文章编号：1674-0432（2011）-11-0195-1
基金项目：延边大学大学生第三届科研项目。
1 材料
1.1 病毒和细胞株 CDV标准病毒、CDV阳性血清和BHK21细胞株购于购自中国兽药监察；犬细小病毒（CPV）、犬腺病毒（CAV）、狂犬病病毒（RV）由延边大学农学院动物医学系预防兽医学实验室保存。30份病料由本实验室从延边大学动物医院门诊采集于犬瘟热疑似病历，用犬瘟热抗原检测卡检测均为犬瘟热病毒感染。
1.2 引物的设计与合成 根据GenBank录入的犬瘟热病毒(CDV)CDV3株F基因（EU263644.1）序列，利用Oligo 6.0软件设计合成了1对引物，即上游引物为：754U20：5`-CCAACCTCAATGCTCAAGC-3`，928L19：5`-ACCCTAATCTCTGCCCAAC-3`。预扩增片段长度约为192bp，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.3 病毒基因组RNA/DNA的制备 取CDV的BHK21细胞适应病毒以及CPV、CAV和RV细胞适应病毒，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒使用说明对各病毒株和处理后的病料样品提取病毒基因组DNA或RNA，-80℃保存备用。
1.4 第一链cDNA的合成 采用20ul反应体系，取制备的CDV基因组RNA为模板，按照M-MLV RNase cDNA Synthesis试剂盒说明，合成CDV基因组RNA的第一链cDNA，-80℃保存备用。
1.5 RT-PCR反应 反应体系为25μl。10╳Buffer 5ul,dNTP(各2.5mM)2.5μl，MgCL2(25mM)2.5μl，Ex Taq酶(1.5U/μl)0.5μl，上下游引物754U20和928L19(10pmol/μl)各1μl，CDV的cDNA产物3μl，用去离子水补至25μl。反应条件为：95℃，5min；94℃，40s；52℃，30s；72℃，15s；30个循环后，72℃，5min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.6 特异性试验 应用病毒基因组DNA提取试剂盒提取CPV和CAV的基因组DNA作为模板，应用病毒基因组RNA提取试剂盒提取RV的基因组RNA，并合成第一链cDNA作为模板，进行特异性比较检测。
1.7 敏感性试验 确定CDV的BHK21细胞适应病毒的感染量为105TCID50，提取病毒基因组RNA，对其反转录产物进行10倍连续稀释（即105、104、103、102、101、100、10-1和10-2），进行RT-PCR检测。
1.8 临床样品的检测 应用建立的RT-PCR方法，对从延边大学动物医院门诊采集的疑似犬瘟热病历的30份病料进行检测。同时应用犬瘟热抗原检测卡进行检测，比较阳性检出率。
2 结果
2.1 RT-PCR反应结果 经初步RT-PCR反应，从琼脂糖电泳结果可以在192bp处见到一条特异的条带，而空白泳道则末见有条带出现（图1），证明该RT-PCR反应成立。
Fig.1 The results of RT-PCR reaction
M: DL2000; 1: CDV; 2: Negative control
2.2 RT-PCR检测CDV的特异性试验 在CDV泳道192bp处可见到一条特异的条带（图略），而CPV、CAV、RV和阴性对照泳道均末见有条带出现，表明建立的CDV RT-PCR检测方法特异性较好。
2.3 RT-PCR检测CDV的敏感性试验 对10倍倍比稀释CDV的cDNA模板进行扩增，结果显示，当CDV稀释到100 TCID50时仍能见到较清晰特异性条带（图略），说明本试验所建立的CDV RT-PCR检测方法具有较强的敏感性。
2.4 临床应用 应用本试验建立的CDV RT-PCR方法和犬瘟热抗原检测卡对来自延边大学动物医院门诊采集的疑似犬瘟热病历的30份病料进行检测。结果表明，RT-PCR检出CDV阳性率为100%，而犬瘟热抗原检测卡检出CDV阳性率为90%。
3 讨论
一般PCR方法选取扩增的目的基因除有保守要求外，还对其扩增长度有一定的要求。多数情况下，扩增基因长度在500bp左右，这样的长度不但可以节省反应时间，而且可以减少非特异性反应。但对于建立RT-PCR检测方法，对扩增目的基因的长度也有在500bp以下的报道，本试验之所以选取192bp短片段作为操作基因，一是为了进一步节省反应时间，使诊断过程简约化，另一点原因就是本课题组的下一步研究考虑建立“犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒联合PCR/RT-PCR检测方法”，而这种方法要求三种病原体目的基因的选取要有明显的差异，经综合考虑，CDV目的基因选择200bp左右最为适宜。从CDV RT-PCR试验结果看，该建立的方法敏感、特异、快速，有利于下一步研究的开展。
参考文献
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作者简介：修占伍（1988-），吉林松原人，本科生，从事动物病毒分子生物学研究。
通讯作者：高旭（1977-），男，吉林德惠人，副教授，从事动物病毒分子生物学与免疫学研究。