[摘要] 目的：探讨单侧尿路梗阻(UUO)模型大鼠肾组织细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的表达及意义。方法：42只SD大鼠随机分为模型组和假手术组。模型组采用UUO术，术后1，3，7，14，21 d和28 d处死动物取肾组织，观察肾组织病理改变；用免疫组化法测定肾组织TGF-β1、磷酸化ERK1/2和CollagenⅠ表达。结果：病理结果显示，UUO 3 d肾小管上皮细胞肿胀、肾间质炎症细胞浸润；UUO 14 d肾组织大量炎症细胞浸润和纤维组织增生，28 d肾小管结构基本破坏，纤维组织弥漫增生。免疫组化显示，正常肾组织有基础TGF-β1、磷酸化ERK1/2和CollagenⅠ的表达。UUO 3 d TGF-β1增加明显，7 d达高峰，此后表达减少；磷酸化ERK1/2的表达在UUO术后3 d明显增加，并持续增加到第7 d，此后表达减少；而UUO术后3 d肾组织CollagenⅠ表达亦明显升高，并持续增加到28 d。模型组肾组织TGF-β1、磷酸化ERK1/2的表达时相一致并呈明显正相关，并与肾间质CollagenⅠ的积聚密切相关。结论：磷酸化ERK1/2信号蛋白在单侧尿路梗阻大鼠肾组织中的表达明显增高，可能在梗阻性肾病肾间质纤维化过程中起重要作用。
[关键词] 单侧尿路梗阻；转化生长因子β1；细胞外信号调节激酶1/2；肾小管间质纤维化
[中图分类号]Q939.9 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）06（c）-021-04
Expression of extracellular signal-regulated protein kinases in unilateral ureteral obstruction in rats
ZHU Sheng-lang,CHANG Ju-ping
(Department of Nephrology,The Sixth Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518052,China)
[Abstract]Objective：To evaluate the expression of extracellular signal-regulated protein kinases in unilateral ureteral obstruction (UUO) in rats and the probable role in thetubulointerstitial injury.Methods：Male SD rats were randomly subjected to either left ureteral ligation or sham operation, and they were sacrificed at 1，3，7，14，21，and 28 days after UUO was initiated. Renal tissue were used for histological and morphometric studies of the pathological change of the obstructed kidney.Immunohistochemical staining was performed to inverstigate the expression of TGF-β1, phosphrylated ERK1/2 and interstitial collagenⅠ.Results：Swelling of tubular epithelia cells and infiltration of inflammatory cells in tubulointerstitium were detected on day 3 after UUO. A diffuse inflammatory cells infiltration,and massive fibrous hyperplasia were detectable on day 14 and 21 after UUO.Most tubules showed serious damage and replaced by proliferative fibrous tissue on day 28. The expression of TGF-β1 in tubulointerstitium of both cortex and medulla on day 3, and the highest expression of TGF-β1 was detected on day 7. Phosphrylated ERK1/2, mainly detected in the nucleus of tubular cells, were also markedly upregulated on day 3, and this was steadily increased by day 7.The expression of interstitial collagenⅠin both cortex and medulla was evident at 3 days and reached the peak by day 28.Conclusion：We discuss the pathological role of TGF-β1, ERK1/2 and collagenⅠin tubulointerstitial fibrosis induced by UUO.These suggest that extracellular signal-regulated protein kinases may play an important role in response to fibrosis in UUO rats.
[Key words]Unilateral ureteral obstruction;Transforming growth factor beta1；Extracellular signal-regulated protein kinases;Tubulointerstitial fibrosis518052）
肾脏纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病进行性发展的共同通路。近年发现，在肾脏病变的过程中肾间质出现成肌纤维细胞并分泌大量的细胞外基质，是肾间质纤维化发生、发展的重要环节。多种细胞因子和生物活性物质对这一过程起调节作用，其中关系最密切的是转化生长因子-β[1]。研究显示，TGF-β1在梗阻性肾病发展过程中表达明显上调，并在诱导细胞外基质产生过程中发挥重要作用[2，3]，但其细胞内信号机制还不清楚。细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen actived protein kinase, MAPK)家族的一个亚族，ERK1和ERK2是两个重要成员，可被多种生长因子和细胞因子激活，介导细胞生长、增殖、分化的信号传导[4]。研究显示[5]，体外培养的大鼠肾脏肌成纤维细胞ERK1/2可被醛固酮激活，并诱导胶原基因的表达和胶原蛋白的合成。本研究旨在观察ERK1/2信号蛋白在单侧尿路梗阻大鼠肾组织中的表达和活化情况，从信号转导的角度探讨梗阻性肾病肾纤维化的发病机制。
1材料与方法
1.1 UUO模型的建立与实验分组
雄性SD大鼠，体重150~200 g，由中山大学北校区实验动物中心提供。UUO模型的制备：3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，无菌手术操作打开腹腔，分离左输尿管，用4-0号线双重结扎并离断输尿管，分层缝合关闭腹腔；假手术组，分离输尿管后即关闭腹腔。
42只大鼠随机分成单侧尿路梗阻（UUO）组（36只）和假手术组（6只）。模型组大鼠行UUO术，分别在术后1、3、7、14、21 d和28 d处死动物，取左侧肾脏，去包膜，吸取尿液后，以10%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋、切片。其中常规染色切片厚度为2 μm，免疫组化切片厚度为4 μm。
1.2 肾组织病理检查
所有标本按常规方法行HE和Masson染色，光镜观察肾小球、肾小管-间质病理变化。
1.3 免疫组化染色
1.3.1 TGF-β1和CollagenⅠ采用LASB法[6]检测肾组织中TGF-β1和CollogenⅠ的表达。石蜡包埋切片，常规经脱蜡至水，枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）微波抗原修复；3%过氧化氢-甲醇浸泡10 min以消除内源性过氧化物酶；滴加预阻断液室温30 min；分别滴加兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体（Santa cruz公司，1∶200）和羊抗大鼠CollogenⅠ多克隆抗体（DAKO公司，1∶100），4℃孵育过夜；滴加生物素化抗兔（羊）抗体（DAKO公司,原液），37℃孵育45 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素（DAKO公司，原液），37℃孵育45 min；最后加3，3"-二氨基联苯胺(DAB)显色，显微镜下控制显色反应，Mayer苏木素复染，中性树胶封片。实验同时采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。TGF-β1和CollogenⅠ以肾实质及间质细胞浆内棕褐色颗粒为阳性。
1.3.2 磷酸化ERK1/2采用Envision法检测肾组织中磷酸化ERK1/2的定位和表达。石蜡包埋切片，常规经脱蜡至水，枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）微波抗原修复；3%过氧化氢-甲醇浸泡10 min以消除内源性过氧化物酶；加0.1%胰蛋白酶(Boehringer Mannhein公司)，37℃消化15 min，正常山羊血清封闭液室温30min；滴加抗磷酸化ERK1/2（DAKO公司，1∶100）单克隆抗体，4℃孵育过夜；滴加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠Envision多聚物（DAKO公司，原液），37℃孵育45 min；DAB显色，中性树胶封片。实验同时采用PBS代替一抗作为阴性对照。以肾实质细胞胞核及胞浆内棕褐色颗粒为阳性。
1.4 免疫组化染色的半定量图像分析
TGF-β1和CollogenⅠ半定量分析：应用IBSA2.5图像分析系统显微镜200倍下随机选取20个肾小管间质视野，按阳性信号所占百分比进行半定量评分后取均值; ERK1/2半定量分析:400倍下分别随机选取20个肾小管间质视野，计算每mm2小管间质的阳性细胞的个数后取均值。
1.5 统计学分析
采用SPSS11.5软件。所有数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析及SNK检验，各指标间相关性采用Spearman相关分析，P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 UUO模型大鼠肾组织病理改变
假手术组肾小球、肾小管大小、形态正常，未见肾小管扩张、间质炎性细胞浸润及纤维增生等改变（图1A）。模型组3 d和7 d肾小管进行性扩张，上皮细胞出现胞浆疏松、浊肿及空泡变性，间质水肿伴逐渐增加的淋巴细胞、单核/巨噬细胞为主的炎性浸润。14 d和21 d肾皮质区可见弥漫性炎症细胞浸润，肾间质面积进一步增宽，其中可见大量纤维组织增生。28 d肾小管结构严重破坏，代之以浸润的炎性细胞和增生的纤维组织（图1B），整个实验过程中肾小球的大小、形态基本正常。
图1不同组肾组织胶原的沉积(Masson染色,×200)
A 假手术组;B 模型组术后28 d
2.2 TGF-β1免疫组化结果(表1)
假手术组肾组织TGF-β1主要表达于皮髓交界的肾小管，肾小球基本无表达（图2A）。模型组3 d TGF-β1的表达明显增加，遍布皮、髓质各损伤肾小管，且表达量随肾小管损伤范围的增加及肾纤维化的加重而明显增高，于第7天达高峰(P<0.01)(图2B)，然后表达逐渐减少，第28天由于肾小管基本破坏而表达极少。
2.3 磷酸化ERK1/2免疫组化结果(表1)
假手术组肾组织近曲小管、远曲小管和集合管具有基础水平磷酸化ERK1/2的表达，肾小球表达极少（图3A）。模型组3 d，近曲小管、远曲小管和集合管磷酸化ERK1/2的表达进行性升高，第7天达高峰(P<0.01) (图3B)，此后表达减少，但仍明显高于假手术组。
2.4Collagen I免疫组化结果(表1)
假手术组肾小球系膜区、基底膜和小血管仅见少量CollagenⅠ的表达，肾间质基本无表达（图4A）。模型组3 d，肾间质区域CollagenⅠ的表达明显升高，且随肾小管损伤范围的增加而明显增高，表达高峰一直持续到28 d(P<0.01)(图4B)。
2.5 UUO大鼠模型TGFβ1、p-ERK1/2与肾小管间质病变的关系(表1)
UUO模型中TGFβ1和p-ERK1/2的表达时相一致，且呈明显正相关(r=0.79, P<0.01)，在7 d表达达到高峰后，不再随病变的加重而进一步升高；而CollagenⅠ的表达持续升高一直持续到28 d。
3 讨论
单侧尿路梗阻是以进行性肾小管-间质纤维化为特征的实验性肾病模型。在梗阻性肾病发展过程中TGF-β1表达明显上调，并在诱导细胞外基质产生过程中发挥重要作用[2,3]，但其细胞内信号机制不完全清楚。有研究显示[5]，体外培养的大鼠肾脏肌成纤维细胞的ERK1/2可被醛固酮激活，并诱导胶原基因的表达和胶原蛋白的合成。但ERK信号蛋白在梗阻性肾病中的作用如何还不清楚。为此，我们制作了单侧尿路梗阻大鼠肾病模型，观察了TGF-β1、磷酸化ERK1/2和CollagenⅠ在梗阻肾组织中的表达情况以及他们之间的相互关系，探索ERK1/2信号蛋白在单侧尿路梗阻模型肾间质纤维化中所起的作用。结果显示，UUO术后TGF-β1、磷酸化ERK1/2和CollagenⅠ的表达持续性增加，肾间质ECM的沉积随着肾间质纤维化的加重而进行性增多。肾组织TGF-β1、磷酸化ERK1/2的表达时相一致并呈正相关，并与CollagenⅠ在肾间质积聚密切相关，提示，ERK1/2信号蛋白在梗阻肾肾间质纤维化过程中可能起重要作用。ERK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它包括5个亚族，ERK1/ERK2、ERK3/ERK4和ERK5，其中ERK1 (p44MAPK)和ERK2(p42MAPK)是两个高度同源的亚类，是MAPK家族中第一个被克隆的成员。胞外信号分子刺激细胞因子受体，通过蛋白酪氨酸激酶的活化，使核苷酸交换因子(SOS)转向质膜，ERK上游的因子Ras蛋白通过异戊烯化修饰定位在细胞膜表面，使Ras-GDP转为有活性的Ras-GTP，从而激活下游因子Raf。活化后的Raf磷酸化并激活下游底物MEK1/2，由此再进一步双磷酸化激活ERK1/2，从而引起核转录因子(如NF-KB等)以及胞浆蛋白和激酶的活化，调控细胞生长、增殖、分化[7]。由上述的激活途径来看，ERK通路是一条瀑布式的反应链，其启动因素对该通路的激活至关重要。由此要问：在单侧尿路梗阻肾病模型中，什么因素激活ERK通路？已有研究发现[8~11]，在肝纤维化、肠纤维化、肺纤维化、心肌纤维化和胰腺纤维化等器官纤维化的发生过程中一些细胞因子如转化生长因子(TGF)，表皮生长因子(FGF)，血小板生长因子(PDGF)，肿瘤坏死因子(TNF)，血管紧张素Ⅱ等均能激活该通路，而其中许多因子与肾纤维化密切相关。Mulsow等[12]发现，TGF-β1可激活Crohn"s病肌成纤维细胞的PKC和ERK1/2信号通路，诱导结缔组织生长因子(CTGF)、纤维连接蛋白和Collagen I的表达，并促进肌成纤维细胞收缩。本试验我们也发现，肾组织TGF-β1表达明显增高，并与ERK1/2活性呈正相关，因此，我们推测本模型中ERK1/2信号蛋白激活可能与该细胞因子的启动密切相关。
总之，本实验提示ERK信号通路可能参与了梗阻性肾病肾纤维化的发生、发展，其激活机制可能与TGF-β1等因素有关，还有待进一步研究及探讨。
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（收稿日期：2007-03-26）
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